ترویج  و آموزش کشاورزی

روش‌های آزمایش سلامت بذر

انواع آزمایشات سلامت بذر

روشهای متعددی برای آزمایشات معمول سلامت بذر وجود دارد که بستگی به طبیعت و محل عامل بیمارگر درون  و یا روی بذر دارند. این روشها توسط ISTA مطرح شده و در آزمایشگاه سلامت بذر ICRADA ثبت و توسعه یافتند این آزمایشات عبارتند از:

بازرسی و مشاهده مستقیم، آزمایش شستشوی سانتریفوژ، آزمایش Blotter، آزمایش Blotter  freezing، آزمایش سياهك هندي، آزمایش Blotter cold، آزمایش جنین، آزمایش پلیت آگار برای قارچ‌ها، آزمایشات پليت آگار و چسبانیدن اسلاید برای باکتری‌ها، آزمایش عصاره‌گیری براي نماتودها، آزمایش شستشو و فیلتر (Filter wash test )، و  تست ELISA (Enzyme linked immunosrbent assay ) برای ویروس ها

روش بازرسی مستقیم: روشی غیر مخرب است و بذر مورد آزمایش در آزمایشات بعدی می‌تواند مورد استفاده قرار گیرد. بذر با چشم غیر مسلح، لنز و یا میکروسکوپ‌های دوچشمی به روش مشاهده‌ای مورد آزمایش قرار می‌گیرد تا سلامت بذر ارزیابی گردد و هر گونه ماده خارجی، غیر طبیعی و بی‌رنگ بودن آن شناسایی شود.

آزمایش شستشو و سانتریفوژ:( wash test Centrifuge)

هدف از آزمایش کشف عوامل بیمارگر‌ی است که به سطح خارجی بذر چسبیده و حمل می‌شوند مانند: تلیوسپور قارچ های Tellitia cares – T. foetida -T. contraveresa – T. indica – Urocystis agropyri Ustilago hordei در گندم و جو  و ااسپور (Oospore) گونه های Peronospora spp در حبوبات دانه‌ای و علفی.

آزمایش سياهك هندي (karnal bunt)

در سیاهک هندی قسمتی از بذر که دچار مقدار جزئی این بیماری شده غالبا با پریکارپ پوشیده شده و با مشاهده بوسیله میکروسکوپ دو چشمی به سادگی قابل شناسائی و تشخیص نیست. تلیوسپورهای T. indica هنگامی که قسمت کوچکی از بذر را آلوده کرده باشند، به ندرت توسط آزمایش شستشو و سانتریفوژ مشاهده می‌شوند. در حالیکه خیساندن بذر در محلول سود (NaOH) به نرم شدن پریکارپ کمک کرده و رها شدن تلیوسپورها را از قسمت های آلوده تسهیل می‌کند.

آزمایش Blotter

در این آزمایش روش‌های خیلی سنتی مورد استفاده در آزمایشگاه‌های سلامت بذر لحاظ می‌شود. این آزمایش برای کشف قارچ‌های اختیاری مرتبط با بذر و هاگ‌های این قارچها و حداقل کردن رقابت ساپروفیت‌ها با عامل بیمارگر به کار می‌رود.

آزمایش Blotter freezing

این روش نوعی آزمایش (Blotter ) اصلاح شده است که جنین فعال توسط یخ زدن کشته شده یا از بین رفته است. این روش آزمایش تشکیل کلونی‌ها را تسهیل می‌کند.

آزمایش cold blotter (CBT)   

آزمایش Blotter  رایج و مرسوم ICARDA برای کشف و شناسايي Pyrenophora graminea در بذر جو است.

دستورالعملهای این روش توسعه کنیدیوسپورها و کنیدی‌ها را افزایش و رشد ساپروفیت‌ها را کاهش می‌دهد. این روش برای کشف خوب و قابل اطمینا ن بذر آلوده در عرض چند روز به کار می‌رود. این روش هیچ گونه خسارت و ضرری به بذر وارد نمی‌نماید.

آزمایش جنین

هدف اصلی این آزمایش کشف عامل بیماری سیاهک آشکار گندم و جو (Ustilago tritici and U. nuda) می‌باشد. عامل بیمارگر که یک انگل اجباری است که به صورت قطعات کوچک میسیلومی در جنین بذر آلوده بقا می یابد.

آزمایش پلیت آگار برای قارچها ( Agar plate test for fungi (APT – F ) ):

شناسایی قارچهای بذرزاد با توجه به خصوصیات کلونی آن ها روی محیط کشت آگار غذایی امکان پذیر می باشد. با این روش قارچ‌های اختیاری مشابه با نتایج روش‌های (Blotter  freezing و Blotter ) کشف می‌شوند. این روش رشد و نمو عامل بیمارگر و تولید اسکلروتیوم[1] و اجسام بارده[2] ) اسپوردوخیوم[3]، پیکنید[4] و آسروول[5] و غیره) را افزایش می‌دهد.

سه مرحله در روش پلیت آگار وجود داردكه عبارتند از: آماده سازی محیط کشت، گذاشتن بذر در محیط کشت و انکوباسیون و آزمایش کلونی‌ها.

آزمایشات پلیت آگار برای باکتریها

محیط کشت های نیمه انتخابی می‌تواند برای جداسازی و خالص‌سازی باکتری‌های مورد نظر یا شناسایی عامل بیمارگر‌ها به وسیله متابولیت‌های قابل انتشار در آگار که تحت اشعه ماوراء بنفش (UV) نور از خودشان ساطع می‌کنند، مورد استفاده قرار گیرد.مانند محیط KingB که برای شناسایی سودوموناس های فلورسنت استفاده می شود.

آزمایش عصاره‌گیری بذر برای نماتودها

هدف از این آزمایش کشف نماتود Ditylenchus dipsaci ( نماتود ساقه لوبيا و غیره) می‌باشد. لارو می‌تواند روی بذر بین پوسته و لپه‌ها و یا در بافت‌ها جای گرفته باشد. بذور آلوده بدون رنگ شده، یا بدون پوسته ترک خورده یا حتی امکان دارد بدون علائم باقی بماند.

آزمایش شستشو و فیلتر(  filter wash test   )

برای کشف بذرهای کوچک علف های هرز انگل صورت می‌گیرد. (Cuscuta spp . Orobanche spp. )

آزمایش كاشت گياه Growing on

این آزمایش خیلی نزدیک به شرایط مزرعه است اما در آن شرایط بهینه برای رشد و نمو بیماری‌ها مهیا شده است . اساس این آزمایش بر طبق علائم گزارش شده روی گیاهچه می‌باشد. مزیت اصلی این روش غیر مخرب بودن آن است (گياهچه می‌تواند تا مرحله بلوغ نگه داشته شود) و تعداد زیادی از عوامل بیمارگر‌ بذرزاد مانند ویروس‌ها، باکتری‌ها و قارچ‌ها می‌توانند کشف شوند. با وجود این محدودیت‌هایی از قبیل تهیه شرایط کنترل شده ویژه عامل بیمارگر، زمان و فضای آزمایش وجود دارد.

آزمایش ELISA (Enzyme linked immuno Sorbent  assay )

این روش بسیار حساس برای ردیابی و شناسایی ویروس‌های گیاهی بر پایه واکنش آنتی بادی – آنتی ژن است. استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال تشخیصی دقیق و سریع ویروس را امکان پذیر می سازد.

کنترل بیماری‌های بذر زاد توسط تیمار بذر

کنترل بيماري‌هاي بذرزاد[6] بوسيله ارقام مقاوم، کنترل بیولوژیکی و يا تيمار بذر امكان پذير است. هدف از تیمار بذر ریشه‌کن کردن کامل یا قابل ملاحظه ارگانیسم‌های بذرزاد و حفاظت دانه‌ها و گياهچه‌های سالم از آلودگی توسط ارگانیسم‌های خاکزاد مي‌باشد.

اصول تيمار بذر عبارتند از:

• تیمارهای بذر غالباً علیه عوامل بیمارگر‌ قارچی و حشرات عمل کرده و در مقابل عوامل ویروسی، نماتدها و باکتری‌ها کمتر مؤثرند.
• آفت‌ها یا عوامل بیمارگر‌ بذرزاد ظرفیت جوانه‌زنی را کاهش داده که این خود منجر به ایجاد گیاهان آلوده و افت عملکرد می‌شود.
• تیمارها نباید قوه نامیه بذر[7] یا رشد گیاه را تحت تأثیر قرار دهند.
• تیمار به عنوان یک حفاظ اضافی عمل می‌نماید و تنها معیار در عمل‌آوری بذر[8] یا انتقال جرم‌پلاسم یا در تولید بذر نمی‌باشد.
• بذرهای دارای آلودگی شدید نباید تحت تیمار قرار گیرند. مگر در موارد دارای ارزش زیاد. کارایی آفت‌کشها زمانی که مقدار زیادی ماده تلقیح وجود دارد، کاهش می‌يابد و مواد شیمیایی نیز به ندرت به طور کامل آفت یا عامل بیمارگر را کنترل می کند.
• مواد شیمیایی مورد استفاده باید سالم و مناسب بوده و به خوبی با بذور در یک دز مناسب آمیخته شوند.
• جهت حذف ارگانیسم‌هایی که در سطح بذر اند از قارچ‌کش‌های تماسی یا سیستمیک و آن هایی که درون بذر اند از قارچ‌کش‌های سیستمیک استفاده شود.
• ترکیب مایع نسبت به ترکیب گرد ارجحیت دارد.

روش‌های تیمار بذر عبارتند از تیمار گرما، تیمار دمای پایین، پوشش بذر با مواد شمیایی[9] و ضدعفونی کردن بوسیله سموم تدخین کننده[10].

1- تیمار گرما:  اعمال گرما توسط آب داغ یا هوای داغ می تواند صورت پذیرد. نکات دارای اهمیت زیاد در تیمار گرما، تخریب عامل بیمارگر توسط گرما  و عدم کاهش توانایی بذر یا بافت قلمه برابرگرما هستند.

آب داغ تنها تیمار به کار رفته در کنترل سیاهک آشکار[11] است.  روش کار در مورد گندم بدین صورت است که ابتدا بذور به مدت 5-4 ساعت در دمای 40-37 درجه سانتی گراد خیسانده و سپس به مدت 10 دقیقه در دمای 54 درجه سانتی گراد نگه داشته و هوا خشک می کنیم .

تیمار آب داغ (60-55 درجه سانتي گراد به مدت 15 دقیقه ) برای حذف باکتری  Pseudomonas syringae pv. pisiاز بذور نخود به کار می رود.

 هوای داغ: غالباً به منظور کنترل باکتری ها وگاهی اوقات نیز برای ریشه کنی ویروسهاي قلمه ها به کار می رود. عموماً زنده مانی گیاه با هوای داغ نسبت به آب داغ بهتر است. تیمارهای هوای داغ برای بذور خشک جو (71 درجه سانتي گراد به مدت 7 روز )، نخود (65 درجه سانتي گراد به مدت 72 ساعت ) و لوبیا (50 درجه سانتي گراد به مدت 72 ساعت و یا 60 درجه سانتي گراد به مدت 24 ساعت ) است . تيمار هواي داغ برای ریشه کنی باکتری های Pseudomonas syringas pv. pisi  , Xanthomonas campestris pv. translucens به کار می رود

2- تیمارهای دمای پایین (دمای 18- تا 20-  درجه سانتی گراد به مدت 7 روز) : برای ریشه کنی حشرات و همچنين براي زماني كه ضد عفونی کردن توصیه نمی شود و یا امکان پذیر نیست.

3- پوشش سطح بذر با مواد شیمیایی: اين روش برای تعداد زیادی از محصولات زراعی شامل حبوبات، گندم ها و سبزیجات استفاده می گردد. مواد شيميايي زيادي به اين منظور مي توانند مورد استفاده قرار گيرند. وسایل و تجهیزات پیشرفته برای حصول اطمینان از سلامت و دقت دُز مصرفي وجود دارند.

دو نوع فرمولاسيون مختلف براي اين مواد شیمیایی در دسترس اند كه عبارتند از گرد (dust) (3-2 گرم در کیلوگرم ) و پودر قابل خیس کردن یا مایع (10-5 ميلي ليتر در كيلوگرم). فرمول های پودر قابل خیس کردن به گرد ترجیح داده می شود به دلیل این که امکان این که دُز دقیقی فراهم شود مهیاست و پوشش بهتری را سبب مي شوند. همچنين برای کاربر خطر کمتری را به همراه دارند و به ماده چسباننده اضافی نیاز ندارند.

تکنولوژی های کاربرد :

• • •  پوشش بذر[12] : تیمار بذور با یک تیمار گرد یا مایع
    •  پوشش[13]: تیمار بذر با مقدار نسبتاً زیادي موادی که به بذور اضافه شده ، صورت می گیرد . شکل تغییر نمی کند و در پایان یک رنگ معمولی را خواهیم داشت .
    • به صورت قرص در آوردن[14] : شکل اصلی بذور مشاهده نمی شود . مقادیر زیاد از مواد امکان دارد اضافه شده باشد.

 انواع قارچ کشها عبارتند از قارچ کش های تماسی (contact action) و  سیستمیک (systemic action)

قارچ کشهای سیستمیک به سرعت توسط بذر جذب شده و بعد از جوانه زنی، درون گیاه توزیع می شوند. این قارچ کشها بذر و گياهچه را در اولین مرحله نمو گیاه محافظت می کنند، نتیجتاً جوانه زنی را سرعت داده و محصول زراعی یکنواخت حاصل می شود.

انواع عوامل بیمارگر:

1- عوامل بیمارگری که به سطح بذر می چسبند :

• گونه های متعدد عامل سیاهک معمولی[15] (Tilletia spp.)
•  سیاهک برگ[16] (Urocystis agropyri)  

2- عوامل بیمارگری که جنین را در حین گلدهی آلوده می کنند:

• گونه های متعدد عامل سیاهک های آشکار[17] (Ustilago spp.)  

3- عوامل بیمارگری که قسمت های زیادی از گیاه را آلوده می کنند:

Helminthosporium spp.

 Colletotrichum spp.

 Ascochyta spp.

قارچ کشهای سیستمیک برای موارد 2 و 3 توصیه مي شوند اما مورد 1 با طیف وسیعی از مواد شیمیایی کنترل می شود.

تجهیزات مورد نياز عبارتند از : فلاسک (نمونه های کوچک) ، بیلچه، مخلوط کننده (concrete mixer)، ظرف استوانه شکل (دستی یا موتوری)،

4- ضد عفونی کردن با تدخین کننده ها:

کنترل حشرات انباري[18] معمولاً توسط ضدعفونی کردن صورت می پذیرد ، تیمار بذر شاید به منظور محافظت گياهچه در مقابل حشرات خاکزاد از قبیل کرم های مفتولی[19]  باشد. ضد عفونی کردن یک روش معمول است که غالباً برای مقابله با حشرات انباري به کار می رود.  روش کار بدین صورت است که حشره کش های فرار را در یک سطح محدود به کار می برند. مزیت عمده ضدعفونی کردن کنترل حشرات در مراحل مختلف زندگی آن هاست . دو ماده شیمیایی ضد عفونی کننده به صورت گسترده ای استفاده می شوند عبارتند از  فوستوکسین[20] و میتل بروماید[21]. سایر مواد عبارتند از : دی اکسید کربن ، اتیلن اکسید ، سیانید هیدروژن و dichlorvos

1- فوستوکسین : در ساخت آن فسفین (فسفید آلومینیوم ) با کربنات آمونیوم و پارافین مخلوط می شود. به شکل جامد یافت می شود( قرص های 6/0 و 3 گرمی). فسفید هیدروژن (PH3) وزن مخصوصی برابر هوا دارد .فسفین قابلیت نفوذ در جعبه ها، کارتن ها و سایر ظروف ( به جز پلاستیکی ) را دارد. دز توصیه شده 5/2 گرم فسفین در متر مکعب می باشد. زمان در معرض قرار گرفتن تیمارها بستگی به دما دارد :

مزیت اصلی فوستوکسین این است که در بذور تجمع پیدا نمی کند، روی مزه یا جوانه زنی تأثیر نمی گذارد و مدیریت آن نیز آسان است .

2- میتل بروماید: درون سيلندرهايي قابل دسترس است. بدون بو بوده، گاهی اوقات برای جلوگیری از نشت آن کلروپیکرین اضافه میشود. 5/3 برابر هوا سنگینی دارد. دز توصیه شده آن به صورت مقابل است: 24 گرم در مترمكعب برای 24 ساعت در دمای    19-10 درجه سانتي گراد و  16 گرم در متر مكعب در دماهای بالای 20 درجه سانتي گراد. ضدعفونی کردن با متیل بروماید در دماهای بالاتر از 25 توصیه نمی شود. حتی المقدور در وسیله های مناسب نگهداری شود و از تکرار کردن ضد عفونی کردن نیز پرهیز شود.

تجهیزات مورد نیاز برای ضدعفونی کردن عبارتند از ورقه های پلاستیکی ضدگاز، درها و پنجره های عایق که مهر و موم شده باشد، سیلو ، اتاق ضدعفونی و آشکارگرها.

ایمنی و سلامت

همه مواد شیمیایی سمی هستند و موارد احتیاطی زیر باید مد نظر قرار گیرند:

1. بذور تیمار شده باید دارای برچسب بوده و در جایی که غذای انسان یا دام نگهداری می شود قرار نگیرند.
2. تیمار کردن بذرها باید در جایی که تهویه مناسب دارد صورت گیرد.
3. لباس های محافظ باید پوشیده شود.
4. ظروف خالی باید به درستی مرتب شوند.

مواردی که در ضدعفونی کردن باید لحاظ شود:

1. 1. 1. لباس های محافظ (ماسک های صورت و دستکش های پنبه ای )
      2. آشکارگرها: گاز هالید برای میتیل بروماید همراه با یک تیوب ( لوله ) برای فوستوکسین .

[1] - Sclerotia

[2] - fructfication body

[3] - sporodochia

[4] - pycnidia

[5] - acervuli

1- seed borne - diseases

2- seed viability

[8] - seed processing

[9] - seed dressing

[10] - fumigation

[11] - loose smut

[12] - dressing

[13] - coating

[14] - Pelletting

[15] - common bunt

[16] - Flag smug

[17] - loose smuts

[18] - storage insect

[19] - wireworm

[20] - phostoxine

[21] - methyl bromide